現(xiàn)代分子生物學實驗手冊

前言
第一章 基礎(chǔ)篇
第一節(jié) 分子生物學實驗室常用基本器具
一、常用基本器具
二、常用器具的材料
第二節(jié) 通用實驗設(shè)備及其使用方法
一、天平
二、pH計
三、分光光度計
四、微量移液器
五、離心機
六、恒溫箱
七、振搖器
八、超凈工作臺
第三節(jié) 實驗室基礎(chǔ)準備工作
一、實驗用水的制備
二、消毒滅菌
二、液氮的使用
四、實驗器具的硅化
五、實驗用醇及酚類的準備
第四節(jié) 實驗用試劑
一、分子生物學實驗室常用試劑濃度表示法
二、試劑的保存
二、實驗空中試劑的管理
第五節(jié) 安全防護
一、放射性核素的防護
二、危險化學試劑及防護
三、生物安全防護
第二章 核酸的基礎(chǔ)理論
第一節(jié) 核酸
一、核酸的組成與結(jié)構(gòu)
二、核酸的理化特性
三、核酸的光譜學
四、核酸的降解與合成
第二節(jié) 基因與染色體
一、基因
二、染色體
第三節(jié) 細胞分裂周期
一、有絲分裂
二、減數(shù)分裂
第四節(jié) 遺傳信息的傳遞
一、復(fù)制
二、轉(zhuǎn)錄
三、翻譯
第三章 核酸的制備
第一節(jié) 真核細胞DNA的制備
一、概論
二、從培養(yǎng)的動物細胞或組織中提取高分子質(zhì)量DNA
三、血液樣品中DNA的制備
四、殘存蛋白質(zhì)和RNA的檢測
五、真核細胞基因組DNA制備中的注意事項
第二節(jié) 細菌細胞DNA的提取
一、試劑
二、實驗流程
三、制備大分子質(zhì)量細菌DNA的幾個關(guān)鍵步驟
第三節(jié) 質(zhì)粒DNA的分離純化
一、概論
二、氯化銫密度梯度離心法
三、堿裂解法
四、煮沸法
五、試劑盒提取及純化質(zhì)粒
第四節(jié) RNA的制備
一、RNA的結(jié)構(gòu)和分布
二、RNA制備中的關(guān)鍵因素
三、組織細胞總RNA分離制備
第四章 電泳技術(shù)
第一節(jié) 電泳技術(shù)的基本原理
第二節(jié) 影響泳動率的因素
一、樣品
二、支持介質(zhì)
三、電場強度
四、緩沖液的離子強度
第三節(jié) 凝膠電泳的基本技術(shù)和條件
一、核酸凝膠電泳的分類
二、緩沖液系統(tǒng)
三、樣品的配制
四、電泳條件的考慮
五、染色
六、電泳結(jié)果的記錄
第四節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳
一、儀器設(shè)備及材料
二、電泳操作步驟
第五節(jié) 堿性瓊脂糖凝膠電泳
第六節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳
一、儀器設(shè)備及試劑
二、制膠準備
三、制膠
四、電泳
五、染色及結(jié)果觀察
第七節(jié) 雙向電泳
一、等電聚焦電泳
二、SDS-聚丙烯酥胺凝膠電泳
三、雙向電泳結(jié)果的分析鑒定
第八節(jié) 凝膠掃描、成像系統(tǒng)
第五章 工具酶
第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶
一、概述
二、常用的三種內(nèi)切酶
三、其他類型內(nèi)切酶
四、甲基化酶
五、與內(nèi)切酶相關(guān)的幾個概念
六、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
七、DNA分子的限制性內(nèi)切酶酶譜
第二節(jié) DNA重組常用的其他酶類
一、DNA聚合酶
二、RNA聚合酶
三、DNA連接酶
四、反轉(zhuǎn)錄酶
五、核糖核酸酶A
六、核糖核酸酶T1
七、核糖核酸酶H
八、核糖核酸酶U2核糖核酸酶CL3
九、脫氧核糖核酸酶Ⅰ
十、核酸酶S1
十一、核酸酶Bal3l
十二、核酸外切酶
十三、末端轉(zhuǎn)移酶
十四、多核背酸激酶
十五、堿性磷酸醋酶
第六章 基因克隆技術(shù)
第一節(jié) 目的基因DNA的制備
一、從染色體中獲得
二、人工合成
三、聚合酶鏈式反應(yīng)擴增特定的基因片段
第二節(jié) 基因克隆載體
一、質(zhì)粒
二、噬菌體
三、真核細胞為宿主的克隆載體
四、反轉(zhuǎn)錄病毒載體
第三節(jié) DNA分子的體外重組
一、DNA連接酶
二、外源性基因DNA片段與載體DNA的連接
二、影響DNA連接的因素
四、DNA在凝膠內(nèi)的連接
第四節(jié) 重組DNA導(dǎo)入宿主細胞
一、轉(zhuǎn)化的方法
二、氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(全部過程需無菌操作)
三、重組DNA克隆的篩選與鑒定
第五節(jié) 基因組文庫的構(gòu)建
一、構(gòu)建基因文庫的準備條件
二、基因文庫的構(gòu)建
第六節(jié) cDNA文庫的構(gòu)建
一、總RNA的提取及mRNA的制備
二、cDNA文庫的構(gòu)建
第七章 聚合酶鏈式反應(yīng)
第一節(jié) PCR基本原理
一、基本原理
二、長產(chǎn)物片段與短產(chǎn)物片段
三、平臺效應(yīng)
第二節(jié) PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
一、標準PCR反應(yīng)流程
二、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
第三節(jié) 引物的設(shè)計
一、設(shè)計原則
二、引物長度
三、引物的5''端修飾法
四、簡并引物
五、嵌套引物
第四節(jié) PCR反應(yīng)模板的制備
第五節(jié) 耐熱DNA聚合酶
一、TagDNA聚合酶
二、其他耐熱DNA聚合酶
第六節(jié) 熱啟動PCR
一、熱啟動PCR的原理
二、熱啟動PCR的幾種技術(shù)
第七節(jié) 降落PCR
第八節(jié) PCR相關(guān)技術(shù)的發(fā)展
一、不對稱PCR
二、多重PCR
三、著色互補PCR
四、巢式PCR
五、錨定PCR
六、反向PCR
七、鍋柄PCR
八、增敏PCR
九、重組PCR
十、表達PCR
十一、原位PCR
十二、RNA的聚合酶鏈反應(yīng)
十三、cDNA末端快速擴增
十四、差異顯示PCR
十五、定量PCR
第九節(jié) PCR產(chǎn)物的檢測
一、瓊脂糖凝膠電泳
二、聚丙烯酰胺凝膠電泳
三、層析技術(shù)
四、分子雜交
五、微孔板夾心雜交法
六、限制性內(nèi)切酶酶切分析
七、酶免疫法檢測PCR
八、PCR擴增產(chǎn)物的直接測序
第十節(jié) PCR的污染及對策
一、PCR污染
二、污染的預(yù)防
三、對照實驗
四、污染源的處理
第十一節(jié) PCR技術(shù)的應(yīng)用
一、基因分析
二、定序克隆
三、序列分析
第八章 核酸分子探針的標記
第一節(jié) 概述
一、探針的種類及其選擇
二、各種標記物及其選擇
三、各種標記方法及其選擇
第二節(jié) 非放射性DIG標記方法
一、非放射性DIG標記方法的比較
二、PCR標記法
三、隨機引物標記法
四、體外轉(zhuǎn)錄標記RNA探針
五、三種標記方法重要參數(shù)的比較簡表
第三節(jié) 探針標記效率的評估
一、直接檢測過程
二、瓊脂糖凝膠電泳分析PCR標記探針
第九章 核酸分子雜交
第一節(jié) Southern雜交
一、瓊脂糖凝膠分離DNA樣品
二、DNA的轉(zhuǎn)膜(Southern印跡虹吸印跡法)
三、預(yù)雜交
四、DIG標記的DNA探針與靶DNA的雜交
第二節(jié) RNA探針的Northern雜交
一、瓊脂糖凝膠分離RNA樣品
二、RNA的轉(zhuǎn)膜(Northern印跡虹吸印跡法)
三、預(yù)雜交
四、DIG標記的RNA探針與RNA的雜交
五、做核酸雜交時如何取得良好結(jié)果
第三節(jié) 非放射性核素探針的檢測
一、光學檢測
二、化學發(fā)光檢測
第四節(jié) 使用DIG標記的探針進行菌落和噬菌斑的雜交
一、菌落/噬菌斑濾膜的準備步驟
二、DIG標記的DNA探針與菌落/噬菌斑濾膜的雜交
三、化學發(fā)光法檢測探針-靶基因雜交信號
四、顯色法檢測探針-靶基因雜交信號
五、菌落/噬菌斑雜交的影響因素
第五節(jié) 核酸原位雜交
一、核酸原位雜交的基本要點
二、結(jié)果的評定
附：Western印跡檢測表達蛋白質(zhì)
一、哺乳細胞的裂解
二、蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移
三、封閉
四、靶蛋白與第一抗體反應(yīng)
五、與第二抗體反應(yīng)
六、顯色
第十章 測序
第一節(jié) 概論
第二節(jié) Sanger雙脫氧法
一、基本原理
二、經(jīng)典測序反應(yīng)――M13單鏈測序系統(tǒng)
三、雙鏈DNA測序反應(yīng)系統(tǒng)
四、循環(huán)測序法
五、PCR產(chǎn)物百接測序
第三節(jié) Maxmam-Gnbert化學法
一、化學法基本原理
二、化學法測序的一般流程
三、化學法的優(yōu)缺點
第四節(jié) 雜交測序
第五節(jié) 自動化測序
一、自動化測序儀
二、全自動化測序流程
第六節(jié) DNA大片段序列測定的戰(zhàn)略
一、隨機測序
二、定向測序法
三、全基因組測序策略
第七節(jié) DNA測序技術(shù)新進展
第十一章 新技術(shù)
第一節(jié) mRNA差異顯示技術(shù)
一、概述
二、基本原理
三、實驗設(shè)計和優(yōu)化
四、實驗操作
五、差異顯示技術(shù)衍生的方法
六、差異顯示技術(shù)的應(yīng)用
七、存在的問題和解決的策略
八、展望
第二節(jié) 生物芯片
一、生物芯片技術(shù)的基本原理
二、生物芯片技術(shù)的特點
三、生物芯片的應(yīng)用
四、生物芯片技術(shù)存在的問題及發(fā)展前景
第三節(jié) 激光捕獲纖維切割技術(shù)
一、LCM技術(shù)的主要原理及簡單操作
二、LCM技術(shù)的特點、存在問題及相應(yīng)對策
三、LCM技術(shù)在生命科學研究中的應(yīng)用狀況
四、LCM技術(shù)的發(fā)展前景
第十二章 生物信息學及其在分子生物技術(shù)中的應(yīng)用
第一節(jié) 概述
一、生物信息學的概念
二、生物信息學的發(fā)展
三、生物信息學的研究現(xiàn)狀
第二節(jié) 生物信息學的研究方法和內(nèi)容
一、研究方法
二、研究內(nèi)容
第三節(jié) 生物信息數(shù)據(jù)庫
一、生物信息數(shù)據(jù)庫及其分類
二、生物信息數(shù)據(jù)庫介紹
三、數(shù)據(jù)庫的查詢
四、全球生物信息數(shù)據(jù)庫
第四節(jié) 序列比對和數(shù)據(jù)庫搜索
一、序列比對
二、數(shù)據(jù)庫搜索
第五節(jié) 生物信息學的應(yīng)用
一、序列分析
二、核酸序列裝配和拼接
三、電子基因定位
四、基因表達的電子組織分布
五、功能預(yù)測
六、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測
七、向數(shù)據(jù)庫提交序列
八、SNP分析
第六節(jié) 研究實例
一、實例一
二、實例二
三、其他研究路線
附錄
一、遺傳密碼子表
二、常用的緩沖液和試劑
三、鉻酸洗液及配制方法
四、放射性核素資料
五、核酸及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)
六、常用分子質(zhì)量標準參照物
七、細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的常見問題、原因及解決方法
八、分子生物學研究中的網(wǎng)上資源
縮略語
索引