現(xiàn)代分子生物學技術(shù)與實驗技巧

第一章分子生物學技術(shù)概述1
一、引言1
二、目的基因的獲取1
三、克隆載體的構(gòu)建和選擇2
四、載體的轉(zhuǎn)化2
五、重組子的篩選3
六、基因表達4
七、生物工程技術(shù)的應用5
參考文獻6
第二章核酸提取技術(shù)7
第一節(jié)質(zhì)粒DNA的提取7
一、引言7
二、堿裂解法小量質(zhì)粒提取所需的儀器、材料及基本步驟8
三、Promega質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒操作程序9
四、注意事項10
五、實驗結(jié)果說明10
六、疑難解析10
第二節(jié)基因組DNA的提取12
一、引言12
二、從植物組織提取基因組DNA13
三、從動物組織提取基因組DNA14
四、細菌基因組DNA的制備15
五、用DNA提取試劑盒從全血和組織中提取基因組DNA15
六、注意事項17
七、實驗結(jié)果說明18
八、疑難解析18
第三節(jié)RNA的提取19
一、引言19
二、實驗設計思路和基本步驟20
三、實驗結(jié)果說明24
四、疑難解析24
參考文獻25
第三章目的基因的獲取及鑒定技術(shù)27
第一節(jié)普通PCR27
一、普通PCR的基本概念和原理27
二、普通PCR技術(shù)的實驗方法28
三、疑難解析33
第二節(jié)實時熒光定量PCR34
一、實時熒光定量PCR的基本概念和原理34
二、實時熒光定量PCR的定量方法38
三、熒光定量PCR的實驗方法43
四、熒光定量PCR技術(shù)的應用48
五、疑難解析54
第三節(jié)環(huán)介導恒溫擴增法快速檢測病原菌57
一、引言57
二、環(huán)介導恒溫核酸擴增的原理58
三、實驗設計思路和基本步驟60
四、實驗結(jié)果68
五、疑難解析69
六、小結(jié)72
參考文獻74
第四章載體的構(gòu)建和鑒定78
第一節(jié)克隆載體78
一、pBR322載體78
二、pUC8——一種Lac選擇型質(zhì)粒80
三、pGEM3Z——克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄80
四、柯斯質(zhì)粒載體81
第二節(jié)表達載體82
一、原核表達載體82
二、真核表達載體84
第三節(jié)載體構(gòu)建中的關(guān)鍵工具和步驟90
一、關(guān)鍵工具90
二、關(guān)鍵步驟91
第四節(jié)載體構(gòu)建的應用舉例93
一、實驗材料93
二、實驗方法94
參考文獻98
第五章細菌轉(zhuǎn)化與細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)100
第一節(jié)細菌轉(zhuǎn)化100
一、基本原理100
二、實驗設計思路和基本步驟101
三、實驗結(jié)果及分析102
四、疑難解析102
第二節(jié)細胞轉(zhuǎn)染104
一、基本原理104
二、實驗設計和基本步驟107
三、實驗結(jié)果及分析108
四、疑難解析109
參考文獻110
第六章外源基因表達的鑒定112
第一節(jié)Northern Blot112
一、引言112
二、實驗設計思路和基本步驟112
三、實驗結(jié)果說明115
四、疑難解析116
第二節(jié)RTPCR116
一、引言116
二、實驗設計思路和基本步驟117
三、實驗結(jié)果說明119
四、疑難解析119
第三節(jié)Western Blot120
一、引言120
二、實驗設計思路和基本步驟120
三、實驗結(jié)果說明125
四、疑難解析125
第四節(jié)ELISA126
一、引言126
二、實驗設計思路和基本步驟128
三、實驗結(jié)果說明130
四、疑難解析131
參考文獻132
第七章報告基因分析134
第一節(jié)報告基因的定義和種類134
一、報告基因的定義134
二、常用的報告基因134
第二節(jié)應用報告基因分析基因的轉(zhuǎn)錄活性135
一、實驗原理135
二、實驗設計和基本步驟136
三、實驗結(jié)果分析137
四、疑難解析139
第三節(jié)報告基因在動物活體成像中的應用140
一、實驗原理140
二、實驗設計和基本步驟142
三、實驗結(jié)果分析143
四、疑難解析144
參考文獻145
第八章差異基因表達譜分析147
第一節(jié)基于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)組學分析147
一、引言147
二、實驗基本步驟和注意事項147
三、雙向電泳實驗結(jié)果說明及疑難解析154
四、質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析說明及疑難解析154
五、結(jié)語160
第二節(jié)基因芯片160
一、引言160
二、工作原理161
第三節(jié)基因芯片的制備163
一、概述163
二、探針的選擇和制備164
三、基因芯片基片的選擇和準備165
四、基因芯片的制作166
第四節(jié)基因芯片的檢測168
一、基因芯片的雜交和數(shù)據(jù)獲取168
二、基因芯片分析常用的軟件和數(shù)據(jù)庫170
第五節(jié)基因芯片的應用171
一、基因芯片與病原微生物檢測171
二、基因芯片與腫瘤172
三、基因芯片與藥物研發(fā)174
四、結(jié)束語176
參考文獻177
第九章蛋白質(zhì)核酸相互作用技術(shù)178
第一節(jié)凝膠遷移實驗178
一、引言178
二、實驗設計與基本步驟179
三、實驗舉例與結(jié)果說明184
四、需要注意的問題186
第二節(jié)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)187
一、引言187
二、實驗基本步驟188
三、實驗舉例190
四、實驗注意事項191
第三節(jié)RNA沉降192
一、實驗基本原理192
二、實驗基本思路193
三、實驗舉例說明198
參考文獻199
第十章蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)200
第一節(jié)運用酵母雙雜交技術(shù)篩選與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)200
一、引言200
二、實驗設備及材料201
三、實驗設計流程202
四、實驗方法202
五、實驗結(jié)果說明208
六、疑難解析212
第二節(jié)GST沉降213
一、實驗基本原理213
二、實驗基本步驟213
三、實驗舉例216
四、實驗注意事項220
第三節(jié)免疫共沉淀221
一、引言221
二、實驗設計和基本步驟222
三、實驗結(jié)果舉例223
四、需要注意的問題226
第四節(jié)細胞共定位226
一、引言226
二、實驗設計和基本步驟227
三、實驗結(jié)果舉例說明227
四、實驗注意事項229
參考文獻229
第十一章微生物體內(nèi)同源重組技術(shù)231
第一節(jié)傳統(tǒng)的大腸桿菌體內(nèi)同源重組方法（RecA重組系統(tǒng)）231
一、引言231
二、利用RecA重組系統(tǒng)構(gòu)建痢疾桿菌hns基因插入突變體231
三、RecA重組系統(tǒng)構(gòu)建突變體的其他方法234
四、存在的問題和解決方法235
五、小結(jié)235
第二節(jié)Red/ET重組系統(tǒng)236
一、引言236
二、痢疾桿菌酸hns基因缺失突變體的構(gòu)建237
三、Red同源重組技術(shù)應用策略239
四、應用Gap-Repair克隆技術(shù)構(gòu)建pBR322-Red載體241
五、Red/ET重組系統(tǒng)的其他應用244
六、小結(jié)244
參考文獻244
第十二章轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)246
第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物概述246
一、轉(zhuǎn)基因動物的概念246
二、轉(zhuǎn)基因動物的分類246
三、轉(zhuǎn)基因動物的命名247
四、轉(zhuǎn)基因動物的基本原理248
五、轉(zhuǎn)基因動物的安全性和倫理學問題249
六、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的發(fā)展概況250
第二節(jié)顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因動物251
一、儀器設備及材料251
二、實驗動物準備252
三、轉(zhuǎn)基因動物制備方法253
四、影響轉(zhuǎn)基因動物效率的因素256
第三節(jié)利用ES細胞制備轉(zhuǎn)基因動物257
一、ES細胞的研究歷史257
二、ES細胞的生物學特性257
三、ES細胞分離培養(yǎng)的基本方法258
四、ES細胞的遺傳修飾262
五、轉(zhuǎn)基因制備269
參考文獻270
第十三章基因打靶技術(shù)271
一、基因打靶技術(shù)的原理271
二、利用同源重組構(gòu)建基因打靶動物模型的基本步驟272
三、基因打靶的策略274
四、基因打靶的生物學意義和應用前景286
參考文獻287
第十四章流式細胞術(shù)實驗方法291
一、引言291
二、實驗方法294
三、實驗結(jié)果分析299
四、流式細胞分析的質(zhì)量控制309
參考文獻311
第十五章干細胞的分離培養(yǎng)與誘導分化313
第一節(jié)人胎盤來源間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與純化313
一、引言313
二、材料、試劑與主要儀器設備314
三、實驗方法315
四、實驗結(jié)果318
五、注意事項321
第二節(jié)小鼠間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與純化324
一、引言324
二、骨髓法325
三、密質(zhì)骨法325
第三節(jié)人胚胎干細胞的培養(yǎng)334
一、引言334
二、實驗材料335
三、實驗方法335
四、注意事項339
第四節(jié)CD34+造血干細胞與CD14+單核細胞向樹突狀細胞的誘導分化339
一、引言339
二、實驗材料與方法340
三、實驗結(jié)果343
四、注意事項345
參考文獻346
第十六章小RNA的構(gòu)造及實驗技術(shù)351
第一節(jié)miRNA克隆351
一、材料與設備352
二、實驗方法352
三、疑難解析355
第二節(jié)miRNA Northern Blot355
一、材料與設備355
二、實驗方法356
三、疑難解析357
第三節(jié)miRNA原位雜交357
一、材料與設備357
二、實驗方法358
三、疑難解析359
第四節(jié)基于poly(A)加尾的miRNA RT-PCR359
一、材料與設備359
二、實驗方法360
三、疑難解析361
第五節(jié)miRNA功能研究362
一、miRNA表達檢測362
二、miRNA功能篩選鑒定362
三、miRNA靶基因鑒定364
第六節(jié)siRNA的構(gòu)造及實驗研究365
一、引言365
二、如何進行siRNA實驗368
三、常用siRNA實驗的基本步驟371
四、實驗結(jié)果說明374
五、疑難解析376
參考文獻376
第十七章非編碼RNA數(shù)據(jù)庫及在線分析工具介紹379
一、綜合性非編碼RNA數(shù)據(jù)庫379
二、miRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預測403
三、rRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預測424
四、sRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預測432
五、siRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預測448
六、tRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預測456
七、snoRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫及預測471
參考文獻478