實用神經變性疾病生物學實驗方法與技術

第一章　原代神經細胞培養(yǎng)和細胞功能測定　/ 1
第一節(jié)　原代皮質和海馬神經元培養(yǎng) 1
第二節(jié)　新生小鼠中腦多巴胺能神經元培養(yǎng) 3
一、單層皮質星形膠質細胞表面培養(yǎng)新生鼠中腦多巴胺能神經元 3
二、單層星形膠質細胞表面培養(yǎng)新生鼠中腦多巴胺能神經元及形成
　　神經突觸 9
三、本節(jié)實驗中使用到的試劑和溶液 11
四、注意事項 13
五、常見問題及解決方案 13
六、預期結果 13
七、時間因素 14
第三節(jié)　小鼠神經干細胞培養(yǎng) 14
一、成年鼠神經干細胞培養(yǎng) 14
二、新生鼠海馬神經干細胞的培養(yǎng) 19
三、胎鼠神經干細胞的培養(yǎng) 20
第四節(jié)　原代神經膠質細胞培養(yǎng) 21
一、星形膠質細胞的分離和培養(yǎng) 21
二、新生鼠小膠質細胞的原代培養(yǎng) 23
三、成年鼠小膠質細胞的分離和培養(yǎng) 25
第五節(jié)　小膠質細胞功能實驗 29
一、趨化和遷移實驗 29
二、體外測定小膠質細胞吞噬功能（吞噬尼羅紅微球/a突觸核蛋白/Ab） 30
第二章　模式動物行為學實驗　/ 34
第一節(jié)　Morris水迷宮 34
第二節(jié)　Y-迷宮 36
第三節(jié)　小鼠平衡功能實驗 39
第四節(jié)　抑郁模型的建立和評定 40
一、抑郁癥的模型制作 41
二、抑郁動物的行為學評價 45
第五節(jié)　嗅覺行為功能測定 47
一、埋藏食物小球實驗 48
二、嗅覺迷宮 48
第六節(jié)　大腦中動脈閉塞模型的建立和評定 49
第七節(jié)　運動功能評定 52
一、小鼠肢體力量測試實驗——小鼠抓力測試 52
二、小鼠耐力測試實驗——跑臺實驗 53
第八節(jié)　感覺（痛觸覺）系統(tǒng)評估 54
一、Von Frey Test 54
二、智能熱板儀 56
三、甩尾實驗 57
第三章　神經病理學實驗　/ 59
第一節(jié)　腦組織的取材、保存和標本制作 59
第二節(jié)　脊髓組織的取材、保存和標本制作 62
一、脊髓的取材和保存 62
二、 脊髓冰凍切片的制作 64
第三節(jié)　小鼠腦脊液采集 66
第四節(jié)　海馬腦片場電位的神經電生理記錄方法 67
第五節(jié)　神經免疫組織化學和免疫熒光染色 71
第六節(jié)　透視電鏡標本制作 74
第七節(jié)　老化組織相關病理特殊染色（SA-b-gal 、銀染色） 77
一、神經原纖維纏結（NFTs）染色 77
二、b-淀粉樣蛋白染色 80
三、衰老相關b-半乳糖苷酶染色 82
第八節(jié)　 神經組織高爾基染色 83
第九節(jié)　神經組織體視學分析技術 86
第十節(jié)　共聚焦掃描及定量技術 92
一、激光共聚焦顯微鏡的成像原理 92
二、激光共聚焦顯微鏡在神經變性疾病研究中的運用 93
三、激光共聚焦顯微鏡結構 95
四、基本掃描及圖像獲取 95
五、微分干涉差（DIC）掃描及圖像獲取 102
六、拼圖掃描及圖像獲取 103
七、Z-Stack掃描及圖像獲取 103
八、時間序列掃描 105
九、激光共聚焦圖像定量及后處理 106
第四章　神經生化和基因檢測　/ 115
第一節(jié)　轉基因動物的基因型鑒定、保種和管理 115
一、小鼠生殖生理 115
二、小鼠的生長周期 116
三、基因工程鼠飼養(yǎng)繁殖一般流程和注意事項 116
四、常用小鼠品系的概況 117
五、幾種常用神經變性疾病轉基因鼠的介紹和鑒定 118
第二節(jié)　神經組織蛋白檢測 125
一、蛋白質印跡法 125
二、免疫共沉淀原理及步驟 130
三、動物腦組織勻漿檢測Ab 132
第三節(jié)　RNA提取及實時熒光定量PCR技術 134
一、RNA提取 134
二、RT-PCR 135
三、qPCR 135
第四節(jié)　基因芯片檢測 140
一、單核苷酸多態(tài)性芯片實驗 140
二、基因表達譜芯片檢測 142
第五節(jié)　熒光素酶報告基因技術分析啟動子轉錄活性 143
第六節(jié)　熒光定量PCR法檢測端粒酶活性 146
第七節(jié)　中樞神經系統(tǒng)突觸和非突觸線粒體的分離提取 148
第五章　分子影像技術檢測神經變性疾病　/ 157
第一節(jié)　PET/SPECT-CT顯像探針的制備 158
第二節(jié)　fMRI成像技術的原理及其實驗設計與數(shù)據(jù)處理 164
一、fMRI實驗設計 164
二、實驗設備 166
三、實驗數(shù)據(jù)處理 166
四、fMRI實驗相關的準備 169
五、小結 170
第六章　神經變性疾病患者臨床神經評估、樣本保存和數(shù)據(jù)庫建設　/ 171
第一節(jié)　神經變性疾病臨床登記和數(shù)據(jù)庫建立和實施 171
一、臨床研究目標的確立 171
二、研究方案的確立 172
三、組織機構的建立 173
四、病例報告表（CRF）的建立 174
第二節(jié)　神經變性疾病患者血液、腦脊液組織樣本的保存和處理 177
一、血液及血液成分的處理和保存 178
二、腦脊液的處理和保存 179
三、標本DNA的提取和保存 180
　附表6-1　標本保存詳細記錄 180
　附表6-2　關于使用組織樣本開展科學研究的知情同意書 181
第三節(jié)　 神經心理認知障礙測試診斷系統(tǒng) 182
一、醫(yī)生端系統(tǒng) 182
二、用戶管理 183
三、臨床病例登記 183
四、案例管理 186
五、統(tǒng)計打印 190
六、量表管理 191
第七章　神經生物學常用分析及作圖軟件的應用　/ 193
第一節(jié)　Image J神經生物分析軟件的應用 193
一、 Image J神經生物分析軟件的基本功能 193
二、 Image J神經生物分析軟件分析免疫熒光定量技術 197
第二節(jié)　Graphpad Prism 6.0作圖和統(tǒng)計應用 205
一、折線圖 205
二、直條圖 208
三、生存曲線圖 216
四、散點圖 219
五、餅圖 225
第三節(jié)　Logistic回歸、Cox風險模型以及Kaplan-Meier曲線的統(tǒng)計應用 231
一、Logistic回歸分析和ROC工作曲線的制訂 231
二、 Cox回歸分析 238
三、Kaplan-Meier曲線分析 242
第四節(jié)　EndNote×7的應用 245
一、文獻管理 245
二、論文撰寫 245