基因工程（第二版）

1基因工程概述/ 001
1.1基因工程的概念與基本流程/ 001
1.1.1基因工程的概念/ 001
1.1.2基因工程的基本流程/ 002
1.2基因工程的發(fā)展簡(jiǎn)史/ 003
1.2.1基因工程誕生的背景/ 003
1.2.2基因工程的誕生/ 004
1.2.3基因工程的發(fā)展/ 006
1.3基因工程的研究意義和應(yīng)用/ 007
1.3.1基因工程在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用/ 007
1.3.2基因工程在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用/ 008
1.3.3基因工程在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用/ 009
1.3.4基因工程在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用/ 011
本章小結(jié)/ 013
復(fù)習(xí)題/ 013

2基因工程工具酶/ 014
2.1限制性核酸內(nèi)切酶/ 014
2.1.1限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和種類/ 014
2.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的命名/ 016
2.1.3限制性核酸內(nèi)切酶的特征/ 016
2.1.4限制性核酸內(nèi)切酶的同尾酶/ 018
2.1.5影響限制性核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的因素/ 020
2.1.6限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引入與消失/ 022
2.2DNA連接酶/ 023
2.2.1DNA連接酶的作用/ 023
2.2.2不同末端的連接策略/ 025
2.2.3影響DNA連接反應(yīng)的因素/ 027
2.3DNA聚合酶類/ 029
2.3.1大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ/ 029
2.3.2Klenow大片段酶/ 030
2.3.3耐熱的DNA聚合酶Taq/ 030
2.3.4T4噬菌體DNA聚合酶/ 031
2.3.5逆轉(zhuǎn)錄酶/ 032
2.4堿性磷酸酶/ 033
2.4.1堿性磷酸酶防止載體自連/ 033
2.4.2獲得5′末端磷酸基團(tuán)標(biāo)記的探針/ 036
2.5末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶/ 036
2.6其他工具酶/ 037
2.6.1Ⅱs型限制性核酸酶/ 038
2.6.2Cas核酸內(nèi)切酶/ 039
2.6.3Dicer酶/ 039
2.6.4重組酶/ 040
本章小結(jié)/ 043
復(fù)習(xí)題/ 043

3基因工程載體/ 044
3.1克隆載體/ 044
3.1.1質(zhì)粒載體/ 045
3.1.2噬菌體載體/ 053
3.1.3黏粒載體/ 057
3.1.4人工微小染色體/ 058
3.2表達(dá)載體/ 060
3.2.1原核表達(dá)載體/ 060
3.2.2真核表達(dá)載體/ 072
本章小結(jié)/ 076
復(fù)習(xí)題/ 076

4目的基因的獲取與制備/ 077
4.1從基因文庫(kù)獲取目的基因/ 078
4.1.1基因組文庫(kù)的構(gòu)建與篩選/ 078
4.1.2cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建與篩選/ 083
4.2電子克隆法獲取目的基因/ 092
4.2.1利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子克隆/ 093
4.2.2利用基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子克隆/ 093
4.2.3全長(zhǎng)cDNA 的判斷/ 094
4.2.4電子克隆基因的生物信息學(xué)分析/ 095
4.3PCR 獲取與擴(kuò)增目的基因/ 095
4.3.1常規(guī)PCR/ 095
4.3.2反向PCR/ 102
4.3.3反轉(zhuǎn)錄PCR/ 104
4.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR/ 105
4.3.5多重PCR/ 110
4.3.6巢式PCR/ 113
4.3.7不對(duì)稱PCR/ 113
4.3.8RACEPCR/ 114
4.3.9原位PCR/ 114
4.4通過(guò)蛋白質(zhì)工程改建目的基因/ 116
4.4.1蛋白質(zhì)工程的概念/ 116
4.4.2蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變技術(shù)/ 117
4.4.3蛋白質(zhì)工程的定向進(jìn)化技術(shù)/ 121
本章小結(jié)/ 123
復(fù)習(xí)題/ 124

5目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法/125
5.1把目的基因?qū)氪竽c桿菌/ 126
5.1.1自然條件下的轉(zhuǎn)化過(guò)程/ 126
5.1.2感受態(tài)受體細(xì)胞的選擇/ 128
5.1.3外源目的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞的方法/ 129
5.1.4外源基因通過(guò)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入受體細(xì)胞/ 131
5.2把目的基因?qū)虢湍讣?xì)胞/ 133
5.2.1聚乙二醇介導(dǎo)的酵母轉(zhuǎn)化/ 133
5.2.2金屬陽(yáng)離子介導(dǎo)的酵母轉(zhuǎn)化/ 134
5.3把目的基因?qū)胫参锛?xì)胞/ 134
5.3.1DNA直接轉(zhuǎn)移法/ 135
5.3.2農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體介導(dǎo)法/ 137
5.4把目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞/ 141
5.4.1外源基因?qū)腚x體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞/ 142
5.4.2外源基因?qū)朐隗w動(dòng)物細(xì)胞/ 144
本章小結(jié)/ 147
復(fù)習(xí)題/ 147

6陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定/148
6.1遺傳表型檢測(cè)法/ 148
6.1.1利用載體提供的表型特征篩選和鑒定重組DNA分子/ 149
6.1.2利用外源目的基因本身的序列提供的表型特征篩選/ 153
6.2酶切電泳檢測(cè)/ 155
6.2.1凝膠電泳檢測(cè)篩選/ 155
6.2.2限制性核酸內(nèi)切酶酶切分析篩選/ 156
6.3核酸分子雜交/ 158
6.3.1Southern印跡雜交/ 159
6.3.2Northern印跡雜交/ 164
6.3.3蛋白質(zhì)印跡分析/ 167
6.4PCR擴(kuò)增鑒定篩選/ 168
6.5DNA序列測(cè)定/ 169
6.5.1Sanger雙脫氧末端終止法/ 169
6.5.2化學(xué)降解法/ 171
6.5.3自動(dòng)測(cè)序法/ 172
6.5.4二代測(cè)序技術(shù)/ 173
6.5.5三代測(cè)序技術(shù)/ 176
6.5.6單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)/ 179
6.5.7高通量測(cè)序在組學(xué)研究中的應(yīng)用/ 180
本章小結(jié)/ 184
復(fù)習(xí)題/ 184

7基因工程在基因功能研究中的應(yīng)用/185
7.1基因的表達(dá)譜研究技術(shù)/ 185
7.1.1胚胎原位雜交技術(shù)/ 186
7.1.2胚胎抗體染色技術(shù)/ 190
7.1.3基因芯片技術(shù)/ 194
7.2基因的突變研究技術(shù)/ 199
7.2.1化學(xué)誘變/ 199
7.2.2轉(zhuǎn)座子全基因組誘變/ 200
7.3基因敲除技術(shù)/ 204
7.3.1完全基因敲除技術(shù)/ 204
7.3.2條件基因敲除技術(shù)/ 209
7.4基因編輯技術(shù)/ 214
7.4.1鋅指核酶基因敲除技術(shù)/ 215
7.4.2TALEN基因編輯技術(shù)/ 218
7.4.3CRISPR基因編輯技術(shù)/ 221
7.5基因敲減技術(shù)/ 241
7.5.1RNA干擾技術(shù)/ 241
7.5.2Morpholino干擾技術(shù)/ 244
7.6基因過(guò)表達(dá)與異位表達(dá)技術(shù)/ 246
7.6.1GAL4/UAS系統(tǒng)的構(gòu)建/ 247
7.6.2GAL4/UAS定時(shí)開啟系統(tǒng)/ 248
7.7基因的相互作用研究技術(shù)/ 249
7.7.1凝膠遷移率阻滯技術(shù)/ 250
7.7.2染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)/ 250
7.7.3酵母雙雜交技術(shù)/ 253
7.7.4免疫共沉淀技術(shù)/ 256
本章小結(jié)/ 257
復(fù)習(xí)題/ 258

8轉(zhuǎn)基因植物/259
8.1轉(zhuǎn)基因植物研究和生產(chǎn)現(xiàn)狀/ 260
8.1.1轉(zhuǎn)基因植物的研究概況/ 260
8.1.2抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物/ 261
8.1.3抗蟲轉(zhuǎn)基因作物/ 263
8.1.4提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因作物/ 266
8.1.5其他轉(zhuǎn)基因作物/ 268
8.1.6植物生物反應(yīng)器/ 273
8.2轉(zhuǎn)基因植物的篩選與檢測(cè)/ 275
8.2.1報(bào)告基因/ 275
8.2.2分子生物學(xué)檢測(cè)方法/ 277
8.3轉(zhuǎn)基因植物的安全性/ 278
8.3.1轉(zhuǎn)基因安全性的由來(lái)/ 279
8.3.2轉(zhuǎn)基因安全性的爭(zhēng)論/ 279
8.3.3轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)程序/ 284
8.3.4轉(zhuǎn)基因作物安全性的監(jiān)管/ 285
本章小結(jié)/ 287
復(fù)習(xí)題/ 287

9轉(zhuǎn)基因動(dòng)物/288
9.1動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)/ 289
9.1.1顯微注射法/ 289
9.1.2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法/ 294
9.1.3胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法/ 297
9.1.4體細(xì)胞核移植法/ 299
9.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的篩選與檢測(cè)/ 305
9.2.1報(bào)告基因/ 305
9.2.2分子生物學(xué)檢測(cè)方法/ 306
9.2.3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物整體表型的觀察/ 309
9.3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的現(xiàn)狀與應(yīng)用/ 309
9.3.1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的現(xiàn)狀/ 309
9.3.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在基因功能研究中的應(yīng)用/ 310
9.3.3轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動(dòng)物育種中的應(yīng)用/ 311
9.3.4轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用/ 313
9.3.5動(dòng)物生物反應(yīng)器/ 314
本章小結(jié)/ 318
復(fù)習(xí)題/ 318

10基因治療/319
10.1基因治療的概念與策略/ 319
10.1.1基因治療的途徑與策略/ 320
10.1.2基因治療的基本程序/ 321
10.1.3基因治療的發(fā)展、現(xiàn)狀與問(wèn)題/ 323
10.2基因治療的載體/ 328
10.2.1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體/ 328
10.2.2腺病毒載體/ 329
10.2.3腺相關(guān)病毒載體/ 332
10.2.4單純皰疹病毒載體/ 333
10.2.5非病毒載體/ 335
10.3重要疾病的基因治療/ 336
10.3.1遺傳病的基因治療/ 336
10.3.2腫瘤的基因治療/ 342
10.3.3艾滋病的基因治療/ 358
本章小結(jié)/ 367
復(fù)習(xí)題/ 367

參考書目與文獻(xiàn)/368