小黑楊抗逆基因工程育種研究

目錄
前言
1小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 1
1.1 抗生素對(duì)小黑楊葉片離體培養(yǎng)的影響 1
1.1.1 不同濃度卡那霉素對(duì)小黑楊生長(zhǎng)的影響 1
1.1.2 不同濃度G418 對(duì)小黑楊生長(zhǎng)的影響 3
1.2 抑菌劑的抑菌效果及對(duì)小黑楊生長(zhǎng)的影響 4
1.2.1 頭孢類抗生素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制作用 4
1.2.2 AgNO3 對(duì)農(nóng)桿菌的抑制作用 6
1.2.3 抑菌劑對(duì)小黑楊葉片分化的影響 6
1.2.4 AgNO3 對(duì)小黑楊葉片分化的影響 8
1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小黑楊轉(zhuǎn)基因體系的建立 9
1.3.1 不同處理對(duì)小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化的影響 9
1.3.2小黑楊卡那霉素抗性芽的篩選 13
1.3.3 轉(zhuǎn)化株系的擴(kuò)繁與生根 13
1.4 確定小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系 14
2 轉(zhuǎn)betA 基因小黑楊研究 17
2.1 轉(zhuǎn)betA小黑楊的獲得 17
2.1.1 轉(zhuǎn)betA小黑楊抗性不定芽的獲得 17
2.1.2 轉(zhuǎn)betA小黑楊PCR 檢測(cè) 18
2.1.3 轉(zhuǎn)betA小黑楊Southern 雜交 18
2.2 轉(zhuǎn)betA小黑楊耐鹽性分析 19
2.2.1 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)betA小黑楊甜菜堿含量的比較 20
2.2.2 非脅迫下轉(zhuǎn)betA小黑楊甜菜堿含量的時(shí)序變化 20
2.2.3 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)betA小黑楊甜菜堿含量的時(shí)序變化 21
2.2.4 轉(zhuǎn)betA小黑楊在輕度鹽堿地的生長(zhǎng)表現(xiàn) 22
3 轉(zhuǎn)codA 基因小黑楊研究 25
3.1 轉(zhuǎn)codA小黑楊的獲得 25
3.1.1 將codA 整合到小黑楊基因組 25
3.1.2 codA 基因在mRNA 水平的表達(dá) 27
3.2 轉(zhuǎn)codA小黑楊耐鹽堿性分析 28
3.2.1 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)codA小黑楊的生長(zhǎng)表現(xiàn) 28
3.2.2 NaHCO3 脅迫下轉(zhuǎn)codA小黑楊的生長(zhǎng)表現(xiàn) 31
4 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因小黑楊研究 34
4.1 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因小黑楊的獲得 34
4.1.1小黑楊抗蟲(chóng)基因的遺傳轉(zhuǎn)化 34
4.1.2 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因小黑楊PCR 檢測(cè) 35
4.1.3 轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因小黑楊Southern 雜交 35
4.2 轉(zhuǎn)基因小黑楊對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)的毒殺能力 36
5 轉(zhuǎn)TaLEA 基因小黑楊研究 38
5.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的獲得 38
5.1.1 將TaLEA 整合到小黑楊基因組中 38
5.1.2 TaLEA 基因在mRNA 水平的表達(dá) 39
5.2 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的耐鹽性提高 40
5.2.1 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊相對(duì)電導(dǎo)率比較 40
5.2.2 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊丙二醛含量比較 41
5.2.3 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊凈光合速率比較 41
5.2.4 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊葉綠素含量比較 42
5.2.5 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊耐鹽株系的選擇 42
5.3 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的抗旱性提高 43
5.3.1 干旱脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊相對(duì)電導(dǎo)率比較 43
5.3.2 干旱脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊丙二醛含量比較 43
5.3.3 干旱脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊凈光合速率比較 43
5.3.4 干旱脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊葉綠素含量比較 44
5.3.5 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊抗旱株系的選擇 45
5.4 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的耐寒性提高 45
5.4.1 低溫脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊丙二醛含量比較 45
5.4.2 低溫脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊相對(duì)高生長(zhǎng)比較 45
5.4.3 低溫脅迫下轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊冷害指數(shù)比較 46
5.4.4 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊耐寒株系的選擇 46
6 轉(zhuǎn)TaLEA 基因小黑楊表達(dá)特性研究 49
6.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊基因表達(dá)譜分析 49
6.1.1 差異基因的功能分類 49
6.1.2 差異基因的基因本體和代謝途徑分析 49
6.1.3 差異基因的qRT-PCR 驗(yàn)證 52
6.2 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊蛋白表達(dá)譜分析 55
6.2.1 差異蛋白的功能分類 55
6.2.2 差異蛋白與差異基因的比較 56
7 轉(zhuǎn)TaLEA 基因小黑楊生長(zhǎng)穩(wěn)定性研究 62
7.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗期生長(zhǎng)性狀Logistic 模型構(gòu)建 62
7.1.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗高和地徑方差分析 62
7.1.2 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗高年生長(zhǎng)模型構(gòu)建 63
7.1.3 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊地徑年生長(zhǎng)模型構(gòu)建 65
7.1.4 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗高年生長(zhǎng)階段劃分 67
7.1.5 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊地徑年生長(zhǎng)階段劃分 68
7.1.6 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊苗高、地徑與速生期各參數(shù)關(guān)系 68
7.1.7 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系苗高生長(zhǎng)過(guò)程比較 69
7.2 不同地點(diǎn)轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊遺傳穩(wěn)定性分析 71
7.2.1 不同地點(diǎn)轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊樹(shù)高和胸徑的變異 71
7.2.2 不同地點(diǎn)不同轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系A(chǔ)MMI 方差分析 73
7.2.3 不同地點(diǎn)不同轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系的基因型-環(huán)境交互作用 73
7.3 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊多性狀比較 74
7.3.1 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系間各性狀比較 74
7.3.2 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系間各性狀平均值及變異參數(shù)分析 77
7.3.3 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系各性狀相關(guān)分析 77
7.3.4 轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊株系綜合評(píng)價(jià) 79
8 轉(zhuǎn)PsnWRKY70 基因小黑楊研究 81
8.1 生物及非生物脅迫條件下PsnWRKY 時(shí)序表達(dá)特性 81
8.1.1 PsnWRKY 基因及蛋白質(zhì)特征 82
8.1.2 PsnWRKY 蛋白多序列比對(duì)及進(jìn)化分析 83
8.1.3 不同脅迫條件下PsnWRKY 表達(dá)的時(shí)序變化 86
8.2 PsnWRKY70 啟動(dòng)子功能研究 89
8.2.1 PsnWRKY70 啟動(dòng)子的克隆及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定 89
8.2.2小黑楊cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量檢測(cè) 92
8.2.3 酵母單雜交篩選PsnWRKY70 的上游調(diào)控因子 93
8.2.4 酵母單雜交篩選結(jié)果的驗(yàn)證 98
8.3 酵母雙雜交篩選PsnWRKY70 的互作蛋白 100
8.3.1 誘餌載體的構(gòu)建 100
8.3.2 誘餌載體的自激活檢測(cè) 101
8.3.3 WRKY 蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá) 103
8.3.4 pGBKT7-WRKY 與pGADT7-cDNA 共轉(zhuǎn)化后的篩選 103
8.3.5 陽(yáng)性克隆的驗(yàn)證 104
8.3.6 陽(yáng)性克隆所攜cDNA 片段的生物信息學(xué)分析 105
8.3.7 互作蛋白的GST-pull down 體外驗(yàn)證 106
8.4 PsnWRKY70 基因功能研究 111
8.4.1 PsnWRKY70 在小黑楊不同組織部位的表達(dá)特性 112
8.4.2 PsnWRKY70 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 112
8.4.3 轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊的獲得 115
8.4.4 轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊耐鹽性分析 119
8.4.5 轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊耐旱性分析 123
8.4.6 轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊抗病性分析 125
8.4.7 NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)PsnWRKY70小黑楊轉(zhuǎn)錄組分析 128
參考文獻(xiàn) 138