CRISPR基因編輯技術(shù)

第1章　CRISPR-Cas系統(tǒng)概述 001
1.1　引言 002
1.2　CRISPR-Cas分類 003
1.3　2類CRISPR-Cas系統(tǒng) 004
1.4　CRISPR-Cas系統(tǒng)的遞送方法 005
1.5　CRISPR-Cas系統(tǒng)的非基因組編輯方法 005
1.5.1　用CRISPR-Cas13和rCas9靶向RNA 005
1.5.2　CRISPRa/CRISPRi、表觀遺傳修飾和標(biāo)記 006
1.6　CRISPR-Cas商業(yè)化現(xiàn)狀 007
1.7　結(jié)語 007
參考文獻(xiàn) 008

第2章　基因編輯技術(shù)史話 011
2.1　引言 012
2.2　基因編輯技術(shù)的歷史先河：基因打靶技術(shù) 012
2.3　曇花一現(xiàn)：鋅指核酸酶技術(shù)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù) 015
2.4　革命時(shí)代的來臨：CRISPR技術(shù) 018
2.5　結(jié)語 021
參考文獻(xiàn) 022

第3章　基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)的進(jìn)展 025
3.1　引言 026
3.2　基因編輯技術(shù)的發(fā)展 026
3.3　CRISPR-Cas系統(tǒng)的多樣性、分類與演變 028
3.3.1　CRISPR-Cas系統(tǒng)分類及作用原理 028
3.3.2　CRISPR-Cas系統(tǒng)的源起和進(jìn)化 029
3.4　CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用進(jìn)展 031
3.4.1　在細(xì)菌及古菌中的應(yīng)用 031
3.4.2　在真菌中的應(yīng)用 032
3.4.3　在植物細(xì)胞中的應(yīng)用 033
3.4.4　在動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用 034
3.5　CRISPR-Cas系統(tǒng)的前瞻性應(yīng)用 035
3.6　結(jié)語 037
參考文獻(xiàn) 037

第4章　CRISPR-Cas9的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制 043
4.1　引言 044
4.2　CRISPR-Cas9生物學(xué) 044
4.3　Cas9酶 046
4.3.1　Apo酶的雙葉結(jié)構(gòu) 046
4.3.2　HNH和RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域 047
4.4　CRISPR-Cas9效應(yīng)復(fù)合物的組裝 047
4.4.1　sgRNA結(jié)合后的構(gòu)象重排 048
4.4.2　Cas9與sgRNA的相互作用 048
4.4.3　預(yù)排序種子RNA以及Cas9與PAM的相互作用 049
4.5　目標(biāo)搜索與識(shí)別 049
4.5.1　RNA-DNA異源雙鏈 050
4.5.2　PAM識(shí)別 051
4.5.3　局部DNA熔解和R環(huán)形成 051
4.5.4　Cas9誘導(dǎo)的DNA彎曲 053
4.6　靶標(biāo)切割 053
4.6.1　解偶聯(lián)的DNA結(jié)合和切割事件 054
4.6.2　通過HNH-RuvC通訊進(jìn)行DNA協(xié)同切割 054
4.6.3　非靶DNA鏈在HNH重定位中的關(guān)鍵作用 055
4.7　CRISPR-Cas9介導(dǎo)的DNA靶向和切割模型 056
4.8　Cas9直系同源物的結(jié)構(gòu) 056
4.9　結(jié)語 057
參考文獻(xiàn) 058

第5章　CRISPR介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)編輯 063
5.1　引言 064
5.2　針對(duì)組蛋白的表觀修飾 065
5.2.1　轉(zhuǎn)錄激活 065
5.2.2　轉(zhuǎn)錄抑制 066
5.2.3　目前的局限性 067
5.2.4　克服當(dāng)前局限性 069
5.3　針對(duì)DNA的表觀修飾研究 070
5.3.1　DNA甲基化 070
5.3.2　DNA去甲基化 071
5.3.3　使用CRISPR介導(dǎo)的方法探測(cè)新的DNA表觀遺傳修飾 072
5.3.4　m5dC衍生物的氧化 072
5.3.5　N6-甲基脫氧腺苷的發(fā)現(xiàn) 072
5.3.6　發(fā)現(xiàn)新的DNA表觀遺傳修飾 073
5.4　針對(duì)非編碼RNA的表觀遺傳學(xué)功能 074
5.5　化學(xué)和光誘導(dǎo)基因組表觀編輯 075
5.6　表觀基因組編輯與病理和醫(yī)療 076
5.7　超越CRISPR-Cas9 077
5.8　結(jié)語 078
參考文獻(xiàn) 080

第6章　CRISPR-Cas9的脫靶效應(yīng) 089
6.1　引言 090
6.2　最小化CRISPR-Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的策略 091
6.2.1　改善sgRNA-Cas9復(fù)合物的有效濃度和sgRNA-Cas9復(fù)合物遞送 091
6.2.2　sgRNA分子的合理設(shè)計(jì) 093
6.2.3　新的Cas9變體的合理工程設(shè)計(jì) 094
6.2.4　Cas9直系同源物 095
6.2.5　Ⅱ類Cas9直系同源物 096
6.3　CRISPR-Cas9系統(tǒng)中脫靶效應(yīng)的檢測(cè)方法 098
6.3.1　預(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)檢測(cè) 099
6.3.2　WGS 099
6.3.3　ChIP-seq 099
6.3.4　IDLV捕獲 100
6.3.5　BLESS 100
6.3.6　GUIDE-seq 101
6.3.7　LAM-HTGTS 101
6.3.8　Digenome-seq 102
6.3.9　SITE-seq 102
6.3.10　CIRCLE-seq 103
6.3.11　GOTI 103
6.3.12　PEM-seq 104
6.3.13　DISCOVER-seq 104
6.4　結(jié)語 105
參考文獻(xiàn) 105

第7章　CRISPR-Cas9的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?112
7.1　引言 113
7.2　細(xì)胞模型 114
7.3　動(dòng)物模型 118
7.3.1　鼠 118
7.3.2　果蠅 120
7.3.3　斑馬魚 121
7.3.4　豬 123
7.3.5　其他動(dòng)物模型 123
7.4　植物 125
7.5　真菌 127
7.6　細(xì)菌 129
7.7　結(jié)語 133
參考文獻(xiàn) 133

第8章　納米材料遞送CRISPR-Cas系統(tǒng) 136
8.1　引言 137
8.2　納米材料概述 137
8.2.1　納米材料定義及特性 137
8.2.2　納米材料的分類 138
8.2.3　納米材料的應(yīng)用 138
8.3　基因療法簡(jiǎn)介 139
8.4　納米材料遞載CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物應(yīng)用 140
8.4.1　二維納米材料遞送CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物應(yīng)用 140
8.4.2　貴金屬及自組裝納米材料遞載CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物應(yīng)用 143
8.4.3　其他納米材料遞載CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物應(yīng)用 145
8.5　結(jié)語 146
參考文獻(xiàn) 147

第9章　全基因組CRISPR-Cas9基因敲除和轉(zhuǎn)錄激活篩選的實(shí)驗(yàn)方案 149
9.1　引言 150
9.2　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 151
9.2.1　篩選方法 151
9.2.2　sgRNA文庫(kù)的設(shè)計(jì)和選擇 151
9.2.3　構(gòu)建和遞送sgRNA文庫(kù)的方法 152
9.2.4　選擇sgRNA 153
9.3　材料 155
9.3.1　試劑 155
9.3.2　耗材及設(shè)備 160
9.3.3　試劑制備 162
9.3.4　材料準(zhǔn)備 164
9.3.5　步驟 164
9.4　結(jié)語 189
參考文獻(xiàn) 189

第10章　細(xì)菌中的CRISPR-Cas系統(tǒng)及其功能 191
10.1　引言 192
10.2　細(xì)菌中CRISPR的分布 193
10.3　CRISPR-Cas系統(tǒng)在細(xì)菌研究中的應(yīng)用 194
10.3.1　對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行編輯 194
10.3.2　參與細(xì)菌基因的表達(dá)調(diào)控 195
10.3.3　與細(xì)菌生物膜、毒力和細(xì)菌耐藥的關(guān)系 196
10.3.4　參與細(xì)菌與宿主的相互作用 196
10.3.5　與細(xì)菌分型的關(guān)系 197
10.3.6　基于CRISPR系統(tǒng)的細(xì)菌進(jìn)化分析 198
10.3.7　與核酸檢測(cè)的關(guān)系 198
10.4　CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用可能帶來的倫理問題及有害影響 200
10.5　結(jié)語 201
參考文獻(xiàn) 201

第11章　CRISPR-Cas技術(shù)在抵抗病原微生物感染中的應(yīng)用 206
11.1　引言 207
11.2　CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)在病毒相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用 207
11.3　CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)在細(xì)菌和真菌中的應(yīng)用 208
11.4　結(jié)語 209
參考文獻(xiàn) 209

第12章　CRISPR-Cas9在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用 211
12.1　引言 212
12.2　CRISPR-Cas9在免疫相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用 212
12.2.1　造血系統(tǒng)惡性腫瘤疾病機(jī)制及動(dòng)物模型研究 212
12.2.2　CRISPR-Cas9全基因組篩選用于研究復(fù)雜生命過程 213
12.3　CRISPR-Cas9在免疫相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用 214
12.3.1　腫瘤免疫治療 214
12.3.2　治療HIV感染 215
12.4　結(jié)語 217
參考文獻(xiàn) 218

第13章　CRISPR-Cas系統(tǒng)在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用 220
13.1　引言 221
13.2　基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)分類 222
13.2.1　基于Cas9系統(tǒng)的核酸檢測(cè) 222
13.2.2　基于CRISPR-Cas12和Cas14系統(tǒng)的DNA檢測(cè) 223
13.2.3　基于CRISPR-Cas13系統(tǒng)的RNA檢測(cè) 225
13.3　CRISPR-Cas核酸檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)及局限性 227
13.4　結(jié)語 227
參考文獻(xiàn) 228

第14章　CRISPR-Cas9在疾病治療中的應(yīng)用 229
14.1　引言 230
14.2　CRISPR-Cas9系統(tǒng)在癌癥生物學(xué)中的潛在應(yīng)用 230
14.3　CRISPR-Cas9在遺傳性疾病中的作用 231
14.4　CRISPR-Cas9在病毒性疾病中的作用 232
14.5　CRISPR-Cas9在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用 234
14.6　CRISPR-Cas9在過敏和免疫疾病中的作用 234
14.7　結(jié)語 235
參考文獻(xiàn) 236

第15章　CRISPR-Cas在傳染病檢測(cè)和治療中的應(yīng)用 237
15.1　引言 238
15.2　CRISPR-Cas生物學(xué) 238
15.2.1　獲取間隔序列 239
15.2.2　crRNA生成 239
15.2.3　干擾 240
15.3　CRISPR-Cas9技術(shù)概述 242
15.3.1　CRISPR-Cas9基因工程 242
15.3.2　sgRNA文庫(kù)用于篩選基因型-表型 242
15.3.3　使用失活的Cas9調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄 242
15.4　在傳染病中的應(yīng)用 243
15.4.1　了解宿主與病原體的相互作用 243
15.4.2　在傳染病診斷中的應(yīng)用 244
15.4.3　CRISPR-Cas在治療中的應(yīng)用 246
15.5　結(jié)語 249
參考文獻(xiàn) 251