枯草芽孢桿菌細胞工廠創(chuàng)制及應用

目錄
前言
第1章　枯草芽孢桿菌概述　1
1.1　枯草芽孢桿菌系統(tǒng)生物學研究　1
1.1.1　多組學分析不同層次調(diào)控細胞內(nèi)代謝流的作用　1
1.1.2　基因表達調(diào)控中的sRNA和反義RNA　2
1.1.3　翻譯后調(diào)控和變構(gòu)相互作用　3
1.1.4　中心代謝中的酶-酶相互作用　4
1.2　枯草芽孢桿菌代謝調(diào)控元件與基因組改造工具開發(fā)　4
1.2.1　基因表達調(diào)控元件的開發(fā)　4
1.2.2　無誘導表達系統(tǒng)和芽孢桿菌遺傳工具箱　5
1.2.3　合成RNA工具的開發(fā)　6
1.3　枯草芽孢桿菌代謝工程策略　6
1.3.1　模塊化途徑工程　6
1.3.2　限制代謝溢流、降低細胞裂解　7
1.3.3　高通量篩選　7
1.3.4　基因組縮減　7
1.3.5　輔因子工程引導的代謝優(yōu)化　8
1.3.6　轉(zhuǎn)運工程策略　8
1.4　枯草芽孢桿菌底盤細胞改造與構(gòu)建　9
1.4.1　枯草芽孢桿菌底盤細胞的研究進展　9
1.4.2　枯草芽孢桿菌底盤細胞的應用　11
參考文獻　13
第2章　枯草芽孢桿菌代謝元件的挖掘與創(chuàng)新　20
2.1　枯草芽孢桿菌CRISPR工具箱　20
2.1.1　CRISPR-Cas系統(tǒng)及其在基因編輯和表達調(diào)控中的應用　20
2.1.2　基于CRISPR-Cpf1的枯草芽孢桿菌多基因編輯系統(tǒng)　22
2.1.3　基于CRISPR-Cpf1的枯草芽孢桿菌多基因表達調(diào)控系統(tǒng)　30
2.2　基于凝血酶-核酸適配體的代謝調(diào)控元件　36
2.2.1　體外結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換型熒光生物傳感器的構(gòu)建與功能驗證　38
2.2.2　基于DNA適配體的動態(tài)上調(diào)元件的設計、優(yōu)化及應用　41
2.2.3　基于RNA適配體的動態(tài)下調(diào)元件的設計、優(yōu)化及應用　46
參考文獻　51
第3章　枯草芽孢桿菌代謝途徑的設計與重構(gòu)　57
3.1　基于穩(wěn)態(tài)反應動力學模型的代謝途徑瓶頸診斷　57
3.1.1　GlcNAc合成途徑動力學模擬　57
3.1.2　潛在限速步驟存在時GlcNAc合成起始階段動力學模擬　60
3.1.3　GlcNAc合成起始階段的動力學測定　61
3.1.4　GlcNAc合成途徑潛在限速步驟的分析及鑒定　62
3.1.5　阻斷GlcNAc-6-P與GlcNAc之間無效循環(huán)對細胞生長和GlcNAc合成的影響　63
3.1.6　小結(jié)　65
3.2　基于氧化還原力平衡的代謝途徑設計優(yōu)化　66
3.2.1　輔因子工程　66
3.2.2　輔因子工程策略　68
3.3　基于非天然氨基酸的細胞生長與代謝途徑調(diào)控　74
3.3.1　枯草芽孢桿菌中非天然氨基酸系統(tǒng)　75
3.3.2　非天然氨基酸系統(tǒng)用于細胞生長與代謝途徑調(diào)控　76
3.3.3　非天然氨基酸系統(tǒng)用于生物封存　76
3.3.4　小結(jié)　78
3.4　基于功能膜微域的代謝途徑區(qū)室組裝　78
3.4.1　細菌中的功能膜微域　78
3.4.2　FMM在質(zhì)膜上的分布及動力學行為　79
3.4.3　腳手架蛋白FloA和FloT的相關性分析　81
3.4.4　FMM-多酶復合體系統(tǒng)的設計和構(gòu)建　84
3.4.5　動力學模型和代謝物動力學表征底物通道　87
3.4.6　FloT和SPFH結(jié)構(gòu)域過表達對細胞生長的影響　89
3.4.7　FMM-多酶復合體與酶表達的相關性分析　91
3.4.8　工程菌的理化性質(zhì)改造和活細胞檢測　92
3.4.9　FMM改造對細胞生長的影響　95
3.4.10　基于FMM組分修飾的途徑酶組裝　96
參考文獻　98
第4章　枯草芽孢桿菌代謝網(wǎng)絡的組裝與適配　102
4.1　基于基因回路的代謝網(wǎng)絡自動全局調(diào)控　102
4.1.1　枯草芽孢桿菌中可編程生物傳感器耦合CRISPRi基因回路　102
4.1.2　基于雙功能丙酮酸響應基因回路的B.subtilis中心代謝全局控制　116
4.2　基于細胞群體感應的代謝網(wǎng)絡系統(tǒng)　128
4.2.1　枯草芽孢桿菌群體感應系統(tǒng)概述　128
4.2.2　組氨酸激酶KinA改造對芽孢產(chǎn)生的影響　131
4.2.3　構(gòu)建Spo0A-P調(diào)控啟動子表達水平文庫　133
4.2.4　受Spo0A-P激活調(diào)控啟動子的構(gòu)建　135
4.2.5　受Spo0A-P阻遏調(diào)控啟動子的構(gòu)建　136
4.2.6　Phr60-Rap60對Spo0A-P調(diào)控能力的影響　138
4.3　基于多模型驅(qū)動的代謝網(wǎng)絡智能化調(diào)控　140
4.3.1　GSMM搭建及應用　141
4.3.2　基于GSMM驅(qū)動的代謝網(wǎng)絡智能化調(diào)控　144
4.3.3　基于TRNM驅(qū)動的代謝網(wǎng)絡智能化調(diào)控　146
4.3.4　基于多約束模型驅(qū)動的代謝網(wǎng)絡智能化調(diào)控　148
4.3.5　展望　150
4.3.6　小結(jié)　151
參考文獻　152
第5章　枯草芽孢桿菌細胞工廠合成瓜乙酰氨基葡萄糖　158
5.1　中心碳代謝優(yōu)化促進GlcNAc合成　159
5.1.1　阻斷副產(chǎn)物乙偶姻溢流對GlcNAc合成的影響　161
5.1.2　阻斷乙偶姻合成導致副產(chǎn)物乙酸溢流　162
5.1.3　添加碳酸鈣和恒pH補料分批發(fā)酵對GlcNAc合成的影響　164
5.1.4　阻斷副產(chǎn)物乙酸溢流對GlcNAc合成的影響　166
5.2　關鍵酶強化改變碳代謝流分布促進GlcNAc合成　168
5.2.1　N端融合標簽提高關鍵酶CeGNA1表達　169
5.2.2　RBS優(yōu)化對GlcNAc合成及關鍵酶CeGNA1表達的影響　172
5.2.3　整合表達關鍵酶EcGlmS促進碳代謝通量流向GlcNAc合成途徑　173
5.2.4　關鍵酶EcGlmS5，端融合mRNA穩(wěn)定子對GlcNAc發(fā)酵的影響　174
5.3　途徑酶優(yōu)化促進GlcNAc合成　177
5.3.1　丙酮酸積累對胞外pH和胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)的影響　177
5.3.2　關鍵酶CeGNA1定向進化對GlcNAc合成的影響　178
5.3.3　脲酶表達對胞內(nèi)pH及GlcNAc合成的影響　181
5.4　中心氮優(yōu)化促進GlcNAc合成　184
5.4.1　阻斷谷氨酸胞內(nèi)降解途徑對GlcNAc發(fā)酵的影響　185
5.4.2　異源表達谷氨酸脫氫酶對GlcNAc合成的影響　186
5.4.3　異源表達NADH依賴型谷氨酸合成酶對GlcNAc發(fā)酵的影響　187
5.5　展望　190
參考文獻　191
第6章　枯草芽孢桿菌細胞工廠合成人乳寡糖　197
6.1　人乳寡糖與人類健康　197
6.2　枯草芽孢桿菌細胞工廠合成2'-巖藻糖基乳糖　199
6.2.1　2'-巖藻糖基乳糖及其生產(chǎn)簡介　199
6.2.2　枯草芽孢桿菌中GDP-L-巖藻糖從頭合成途徑的構(gòu)建　203
6.2.3　枯草芽孢桿菌中GDP-L-巖藻糖回補合成途徑的構(gòu)建　203
6.2.4　GDP-L-巖藻糖合成培養(yǎng)基的篩選　204
6.2.5　2'-巖藻糖基乳糖的合成與外源巖藻糖基化酶的篩選　205
6.2.6　胞內(nèi)底物運輸及輔因子合成的強化　207
6.2.7　內(nèi)源乳糖轉(zhuǎn)運蛋白強化、膜合成蛋白調(diào)控和途徑酶融合　212
6.3　枯草芽孢桿菌細胞工廠合成乳酰新四糖　218
6.3.1　乳酰-W-新四糖概述　218
6.3.2　枯草芽孢桿菌中LNnT異源合成途徑的構(gòu)建　221
6.3.3　模塊化途徑工程優(yōu)化LNnT合成代謝網(wǎng)絡　228
6.3.4　CRISPRi動態(tài)調(diào)控策略提高LNnT的合成　234
6.3.5　基于啟動子工程的無質(zhì)粒和芽孢LNnT合成菌株的構(gòu)建　242
參考文獻　258
第7章　枯草芽孢桿菌細胞工廠合成維生素K2　262
7.1　維生素K2合成概述　263
7.1.1　七烯甲萘醌　263
7.1.2　傳統(tǒng)提高MK-7合成的策略　266
7.1.3　菌株改造高效合成MK-7　268
7.2　增強前體供應提高MK-7的合成　269
7.2.1　增強甲萘醌典型合成途徑對MK-7合成和細胞生長的影響　271
7.2.2　增強分支酸合成途徑對MK-7合成和細胞生長的影響　273
7.2.3　增強MEP途徑對MK-7合成和細胞生長的影響　274
7.2.4　關鍵基因menA對MK-7合成的影響　276
7.3　動態(tài)調(diào)控MK-7合成途徑及發(fā)酵放大　278
7.3.1　群體感應系統(tǒng)調(diào)控MK-7的合成　279
7.3.2　在5L生物反應器中發(fā)酵合成MK-7　281
7.3.3　在15L生物反應器中發(fā)酵合成MK-7　282
7.3.4　在3 t生物反應器中發(fā)酵合成MK-7　283
7.4　比較轉(zhuǎn)錄組分析限制MK-7合成的因素　284
7.4.1　生物膜的形成對MK-7合成的影響　285
7.4.2　比較轉(zhuǎn)錄組學分析基因表達差異　286
7.4.3　在B subtilis168中過表達差異基因驗證其對MK-7合成的影響　291
7.4.4　在BS20中過表達差異基因驗證其對MK-7合成的影響　292
7.4.5　電子傳遞鏈對MK-7合成的影響　294
7.4.6　搖瓶驗證信號轉(zhuǎn)導與電子轉(zhuǎn)移對MK-7合成的影響　297
7.4.7　15L發(fā)酵罐驗證信號轉(zhuǎn)導與電子傳遞對MK-7合成的影響　297
參考文獻　300
第8章　枯草芽孢桿菌細胞工廠合成乙酰神經(jīng)氨酸　304
8.1盡乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的構(gòu)建和模塊化優(yōu)化　305
8.1.1　NeuAc合成途徑的構(gòu)建　305
8.1.2　GlcNAc和PEP模塊化途徑工程的設計與構(gòu)建　307
8.1.3　GlcNAc和PEP模塊化途徑工程對NeuAc合成的影響　309
8.1.4　中心代謝途徑改造提高葡萄糖向NeuAc的轉(zhuǎn)化率　310
8.1.5　優(yōu)化ytsJ基因表達水平提高蘋果酸向NeuAc的轉(zhuǎn)化率　310
8.1.6　小結(jié)　313
8.2　盡乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑熱力學瓶頸和限速步驟的解除　314
8.2.1　NeuAc合成途徑熱力學瓶頸分析　314
8.2.2　通過關鍵酶自組裝和途徑替換解除NeuAc合成熱力學瓶頸　315
8.2.3　不同表達水平NeuAc合成途徑關鍵酶驗證解析限速步驟　318
8.2.4　基于NeuAc響應元件的NeuB定向進化系統(tǒng)的構(gòu)建　319
8.2.5　通過NeuB定向進化和不同來源高催化活性酶替換緩解NeuAc合成途徑限速步驟的影響　322
8.2.6　小結(jié)　323
8.3　盡乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑所產(chǎn)生細胞代謝壓力的解析和解除　324
8.3.1　強化NeuC途徑對細胞生長和NeuAc合成的影響　324
8.3.2　不同表達水平NeuAc合成途徑關鍵酶對細胞生長和NeuAc合成的影響　325
8.3.3　不同強度三條NeuAc合成途徑復合對NeuAc合成效率的影響　328
8.3.4　小結(jié)　330
8.4　磷酸烯醇丙酮酸高效供給系統(tǒng)的構(gòu)建和優(yōu)化　331
8.4.1　蘋果酸供給PEP系統(tǒng)的構(gòu)建與優(yōu)化　331
8.4.2　葡萄酸供給PEP系統(tǒng)的構(gòu)建與優(yōu)化　332
8.4.3　葡萄糖酸響應元件的構(gòu)建與優(yōu)化　334
8.4.