1800年大選是美國歷史上最激烈而隆重的選舉之一，兩黨之爭達到空前的高潮。聯(lián)邦黨人攻擊共和黨人具有雅各賓主義和恐怖主義傾向，而杰斐遜的支持者則指責對方政治專橫，剝奪了人民的民主權(quán)利，甚至指責他們的目的是恢復貴族政治。最終杰斐遜大獲全勝。在近代史上，反對黨第一次從執(zhí)政黨手中程序性地接管了國家政權(quán)，杰斐遜成了美國歷史上第一位在大選中擊敗執(zhí)政黨當選總統(tǒng)的在野黨領袖。聯(lián)邦黨從此逐漸走進了歷史，隨之而來的是“弗吉尼亞王朝”的延續(xù)和共和黨人長達二十多年的政治統(tǒng)治。

總統(tǒng) 1801年3月4日中午，杰斐遜拒絕衛(wèi)隊的護送和像其前任那樣佩帶寶劍，與幾位朋友一同步行來到會場，發(fā)表了一個旨在清除隔閡，加強合作的就職演說。這個就職儀式是簡短樸實的，充分體現(xiàn)了平民精神和親民原則，為許多后繼者所仿效。

杰斐遜希望建立一個民主、理性和有限權(quán)威的政府，一上任就著手革除積弊，以開創(chuàng)一個體現(xiàn)“1800年革命”精神的嶄新局面。他一貫倡導民主和自治，防止專制暴政，主張嚴格解釋憲法，限制政府權(quán)力。他精簡軍隊，裁撤冗員，促使政府采取措施，開源節(jié)流，減輕民眾負擔，廢除了曾觸發(fā)威士忌酒暴動的聯(lián)邦酒稅。他還廢除了上屆政府頒布的一些為民眾所厭惡的法令，同時致力于消彌黨派分歧。

在總統(tǒng)的日常工作中，杰斐遜保持了廉潔和親民的樸實作風，廢除了許多繁文縟節(jié)和等級差別。他開創(chuàng)了白宮向公眾開放的先例，舉辦宴會時使用圓桌，以取消席位等級，還取消外事活動中的繁瑣禮儀。但有一次，他因穿著睡衣接見英國使節(jié)而受到嘲笑和指責。

在任免問題上，杰斐遜在理論上主張政府向德才兼?zhèn)涞娜碎_放，但在實際操作中采取了務實的態(tài)度，免除了那些政治觀點保守而又缺乏工作能力的人的職務，同時把一批忠于共和主義原則并有能力的人充實進政府各部門。其中，國務卿詹姆斯·麥迪遜和財政部長艾伯特·加勒廷是其最重要的內(nèi)閣成員，他們既是杰斐遜最得力的助手，又是總統(tǒng)忠實的政治追隨者和好朋友。但他堅決反對結(jié)黨營私，以免政府機構(gòu)成了少數(shù)人的專屬領地和以權(quán)謀私的工具。

杰斐遜召回了大部分駐外使節(jié)，為國家節(jié)省了大量資金和寶貴的人力。這也說明，杰斐遜在外交領域奉行孤立主義原則，以盡可能避免參與歐洲事務。

入主白宮后，杰斐遜繼承發(fā)揚了他在蒙蒂賽洛的好客精神，經(jīng)常設宴款待各方賓朋。來客中有內(nèi)閣成員、國會議員、科學家、探險家、藝術家、外國使節(jié)和友人等，也有聯(lián)邦黨人和政治上的反對派。他創(chuàng)造了一種“民主的”進餐制度，即客人們可以隨意就座。杰斐遜這樣做的目的在于：為各方面創(chuàng)造一個機會，加強相互溝通和了解，以消彌隔閡和偏見，創(chuàng)造一種和諧融洽的政治氛圍，同時也可以使他多了解一些外界的信息，聽一聽不同的意見和聲音。